ELISA是蛋白定量的金標(biāo)準(zhǔn)，也是免疫學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一。很多人覺(jué)得ELISA很簡(jiǎn)單，其實(shí)不然。博深生物帶你繞開(kāi)ELISA實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的各種問(wèn)題，輕松搞定ELISA實(shí)驗(yàn)~。
酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)
1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。
酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）用于：
（1）免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位；
（2）研究抗酶抗體的合成；
（3）顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)；
（4）定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。
優(yōu)點(diǎn)：快速、靈敏、定性、定量、定位
實(shí)驗(yàn)原理
1.包被：抗原/抗體，固相化
2.反應(yīng)： 1)待測(cè)抗體/抗原； 2)酶標(biāo)抗原/抗體
3.洗滌：使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離
4.底物顯色：定性/定量分析
常用的酶與底物：
酶底物顯色測(cè)定波長(zhǎng)辣根過(guò)氧化物酶horseradish peroxidase,HRP鄰苯二胺（OPD）橘紅色492nm四甲基聯(lián)苯胺（TMB）黃色450nm堿性磷酸酶alkaline phosohatase,AP4-硝基酚磷酸鹽(p-NPP)黃色405nm終止液：2mol/L H2SO4
常用方法
1.間接法
檢測(cè)抗體最常用的方法, 主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)。
優(yōu)勢(shì)：二抗可以加強(qiáng)信號(hào)，而且有多種選擇能做不同的測(cè)定分析。不加酶標(biāo)記的一級(jí)抗體則能保留它最多的免疫反應(yīng)性。
缺點(diǎn)：交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高
2.雙抗體夾心法
檢測(cè)大分子抗原最常用的方法。
優(yōu)勢(shì)：高靈敏、高專(zhuān)一性，抗原無(wú)須事先純化。
缺點(diǎn)：抗原一定得擁有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位。
3.競(jìng)爭(zhēng)法
檢測(cè)小分子半抗原（藥物、激素等）。
優(yōu)勢(shì)：可適用比較不純的樣本，而且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。
缺點(diǎn)：整體的敏感性和專(zhuān)一性都較差。
常見(jiàn)問(wèn)題分析
Q1.標(biāo)曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色
溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時(shí)，未渦旋震蕩或不夠充分。
標(biāo)準(zhǔn)品溶解、倍比稀釋時(shí)均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復(fù)吹打，效率較低、效果也不一定最佳。
Q2.標(biāo)曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導(dǎo)致顯色偏弱。
推薦孵育階段，使用ELISA專(zhuān)用的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結(jié)合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個(gè)組分，如檢測(cè)抗體、酶等。對(duì)于比較馬虎的新手，一定要做好標(biāo)記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。
Q3.標(biāo)曲顯色，樣本不顯色
當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強(qiáng)，就無(wú)法檢測(cè)到。目前ELISA仍然是蛋白檢測(cè)靈敏度最高的方法，與不同技術(shù)結(jié)合后，衍生出了多種類(lèi)型的ELISA，提高了檢測(cè)靈敏度。
對(duì)于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測(cè)到樣本濃度，只能說(shuō)可以提高樣本的可測(cè)率，并使結(jié)果更加可靠。因?yàn)橥ǔＳ闷胀‥LISA檢測(cè)的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信。
Q4.標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大
這個(gè)問(wèn)題就跟移液器和實(shí)驗(yàn)者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范，就會(huì)造成移液的誤差較大；實(shí)驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對(duì)復(fù)孔的CV也有很大影響。
掌握移液器的正確使用和維護(hù)。關(guān)于個(gè)人的操作可練習(xí)移液動(dòng)作、加快速度，確保移液的精密度。
Q5.本底偏高，樣本值測(cè)不到
標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對(duì)于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時(shí)候，本底過(guò)高會(huì)掩蓋目的信號(hào)，導(dǎo)致無(wú)法測(cè)到樣本值。
在加入TMB顯色后，需實(shí)時(shí)觀察標(biāo)曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見(jiàn)的微弱藍(lán)色，即可終止反應(yīng)。
Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋?zhuān)?jì)算得到的樣本值差異較大
有時(shí)候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應(yīng)該如何稀釋?zhuān)敲次覀兙蜁?huì)做下預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定稀釋倍數(shù)。然而有時(shí)候同一樣本做了幾個(gè)不同梯度稀釋后，計(jì)算得到的樣本值之間差異較大，應(yīng)該選擇哪一個(gè)稀釋倍數(shù)呢？
這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時(shí)，血清中的各種蛋白會(huì)抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應(yīng)較明顯。而經(jīng)過(guò)稀釋后，干擾因素也隨之稀釋?zhuān)绊懢蜁?huì)較小。當(dāng)某兩個(gè)梯度稀釋后，計(jì)算得到的樣本值接近時(shí)，我們就可以認(rèn)為在該稀釋梯度時(shí)，樣本中的干擾因素影響較小，計(jì)算得到的值也是接近真實(shí)的。然而這樣的稀釋是針對(duì)目的蛋白濃度較高的樣本而言。對(duì)于濃度很低的樣本，經(jīng)過(guò)多倍稀釋后，就更加測(cè)不到了，此時(shí)可按照廠家說(shuō)明書(shū)推薦的加樣方式操作。
Q7.不同試劑盒中的組分能否通用
除非是公用的試劑如洗液、檢測(cè)緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、檢測(cè)抗體、酶等)都是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分，有可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。
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